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【央视新闻客户端】

实验方法原理 幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，细胞核较大而细胞质较少 ，核酸浓度高
，且内含物少，次生代谢产物少 ，蛋白质及多糖类物质相对较少
，在SDS或CTAB物质存在时，经机械研磨 ，使细胞破裂释放出内含物
，提取的DNA 、RNA的产量高，纯度好。提取DNA所用的提取液、吸头
、离心管等需要高压灭菌以灭活Dnase
。DNA定量分析可采用紫外光谱分析法。原理是DNA分子在260nm处有特异的紫外吸收峰 ，且吸收强度与DNA的浓度成正比 。此外，还可以通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带的亮度来分析
，因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA的碱基对平面之间而结合于其上 ，在紫外光的激发下产生荧光
，DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比
。

实验内容和实验步骤

1．提取DNA

（1）提取DNA所用的提取液、吸头 、离心管等需要在高压灭菌锅中121℃（约1.1 kg/cm2）高压灭菌20 min。

（2）用液氮将50mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5ml 离心管中加入预热至65℃的600μl 的CTAB提取液 ，轻摇混匀 。

（3）65℃水浴1小时
，其间轻摇混匀
。

（4）12000rpm离心10min，取上清转移至另一1.5ml 离心管中。

（5）向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） ，轻轻混匀10min
，然后12000rpm离心10min，再转移上清入新管 。

（6）向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1） ，轻轻混匀10min
，然后12000rpm离心10min，再转移上清入新管
。

（7）向上清液中加1/10体积的3M NaAC (pH5.2) ，等体积的冷异丙醇，小心混匀。12000rpm离心10min
，弃上清 。

（8）用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm离心 ，弃上清
。

（10）将沉淀在超净工作台上吹干
，加50μl TE (pH8.0)室温溶解。

电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量 。

粗提取植物DNA的实验步骤和原理

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜
、核膜 ，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液
，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA ，产生白色絮状沉淀
，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤 ，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素
，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础
。主要是CTAB方法 ，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法 。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1 、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集
。

2
、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次
，离心收集。试验步骤2再重新作一边 。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀
。

4 、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀 ，50℃水浴3h,

5
、用等体积的酚抽提一次
，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚 ，氯仿
，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿 ，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀
，冰浴，10min. 。

7 、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中
。加入等体积的异丙醇。室温10min 。

2500rpm,离心10min
。弃上清。

8
、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇 。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min
。弃上清。将DNA溶于适量TE中 。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1 、取人肘静脉血5ml ，EDTA抗凝
，2500rpm离心10min
。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3
、在血细胞中加入3倍体积的溶血液 ，摇匀，冰浴15min 。

4、2500rpm离心10min
，弃上清
。

5 、加入10ml溶血液，摇匀 ，冰浴15min。

6
、3000rpm离心10min
，弃上清 。

7、倒置离心管，去掉残液
。

8 、得白细胞 ，－80?C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h
，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶 。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml ，高压灭菌
。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml
，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1
、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl ，充分颠混至清亮 。以4000rpm
，离心5min。弃上清液
。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm ，离心5min 。

3 、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞）
，混匀置于37℃，水溶1h
。

4
、加入8μl的蛋白酶K ，颠混
，37℃过夜（或55℃，3h ，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min
，以5500rpm，离心15min 。

6 、取上清 ，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇
，摇匀10min，以5500rpm ，离心15min
。

7
、取上清
，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min ，以5500rpm，离心15min。

8、取上清
，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满 ，摇匀放入-20℃保存2h以上 。

9 、以12000rpm
，离心20min
。去上清，加入70％乙醇500μl ，以12000rpm
，离心5min，去上清 ，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水
，转弹，混匀 。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1
、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中 ，12000rpm离心12min
。

2、弃上清
，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3 、混匀后加6MNaI溶液200ul ，摇匀20s 。

4
、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇
，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul ，加入另一新eppendorf管中
，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s ，室温放置15min
，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁
。

6 、弃异丙醇 ，加70％乙醇1ml（不振动）
，以15000rpm离心12min。

7
、弃乙醇，敞开eppendorf管盖 ，烘干（37℃恒温箱）后
，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上 ，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用 。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提
，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解 ，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子
，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来
。DNA易溶于水 ，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团
，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层 ，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液 。当有机溶液存在时
，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀
。离心后有机溶剂在试管底层(有机相) ，DNA存在于上层水相中
，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质 。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚
。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐 ，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1 、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中
，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀 ，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清 。重复一次
。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀
，37℃水浴温育1h。

2
、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后 ，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀
，液体变粘稠 。50℃水浴保温3h，裂解细胞 ，消化蛋白。保温过程中
，应不时上下转动几次，混匀反应液
。

3、反应液冷却至室温后 ，加入等体积的饱和酚溶液
，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min ，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中 。重复酚抽提一次
。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）
，上下转动混匀，5000rpm离心15min ，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相
，移至另一离心管中。重复一次 。

4 、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管 ，即有乳白色云絮状DNA出现
。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA
，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml ，以5000rpm离心5min。洗涤DNA
，弃上清，去除残留的盐 。重复一次
。室温挥发残留的乙醇 ，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动
，DNA完全溶解通常需12-24h 。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用
。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织
、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取 ，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析
，还可用于PCR的模板、文库构建等实验 。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法 ，而后的DNA提取方法大体类似
，但都应考虑以下两个原则：

1 、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏
。

试剂准备：

1
、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl 。

3 、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml
。

4
、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6 、Tris饱和酚（pH8.0）
、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7 、无水乙醇
、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml ，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中 。

3)加20%SDS25ml
，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀
。

4)60°C水浴1-3hr。

2 、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后 ，用TBS洗涤一次 。

2)离心4000g×5min
，去除上清液
。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr 。

DNA提取：

1
、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min
。

2 、离心5000g×10min ，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚
，混匀，离心5000g×10min ，取上层水相到另一管中 。

4
、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀
，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清 ，可重复此步骤数次
。

5、加等体积氯仿
，轻轻混匀，离心5000g×10min ，取上层水相到另一管中。

6 、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇
，轻轻倒置混匀 。

7
、待絮状物出现后，离心5000g×5min ，弃上清液
。

8、沉淀用75%乙醇洗涤
，离心5000g×3min，弃上清液。

9 、室温下挥发乙醇 ，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜 。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid
，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中 ，盐溶法是提取DNA的常规技术之一
。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA
，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键 。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中 ，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开
。制备过程中
，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率 ，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA
，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS ，经过2h搅拌
，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去 ，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来 。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1
、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl
，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一 ，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml
。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠
，分别溶解，一起定容至1000ml。

3 、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍 。

4
、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液 ，用1mol/LHCl
，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）
。

6 、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7
、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g ，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml 。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止
，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤 ，冷却之后即将滤液放入冰箱
，待结晶出现再置室温下凉干待用
。

9 、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH 。

11
、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸 ，装入棕色瓶
，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕
。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13 、0.05mol/LNaOH 。

14
、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中 ，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中
，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度 ，则得100μg/ml的标准溶液
。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中
，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2 、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液 ，加上塞子
，剧烈振荡30s，转入离心管 ，静置片刻以脱除组织蛋白质 。以4000rpm离心5min
。

3
、离心形成三层
，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4 、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min） ，以灭活组织的DNA酶
，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕 ，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L 。

5
、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min
，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇 ，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上
，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动
。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7 、然后加入0.5ml左右的10×SSC ，使最终浓度为1×SSC 。

8
、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品
。

9、加入已处理的Rnase溶液
，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min ，以除去RNA。

10 、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液
，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白 ，室温下以4000rpm离心5min
，收集上层水溶液 。

11、再按6
、7步骤处理即可得到纯化的DNA液
。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中 ，在液氮中研磨成粉末。

2 、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中
，温育30min 。

3
、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1) ，充分混匀
，室温下2300转离心20min
。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀 ，2300rpm离心20min 。

5 、转移上清至另一新的15ml离心管中
，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀
。1000rpm离心10min ，使DNA沉淀于管底。

6
、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜 。

7、待DNA完全溶解后
，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA ，置于15ml离心管中
，用70%乙醇清洗30min。

8 、离心机甩5s，倒出70%乙醇 ，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇
，在超净工作台上吹干
。

9
、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热 。

2 、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃ ，10min
。

3
、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
，振荡，以12,000rpm ，离心10min。

4、取上清
，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm ，离心10min 。

5 、重复再作一次步骤4
。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇）
，－20C下沉淀。

7
、以2,000rpm，离心10min 。

8、弃上清 ，以70％乙醇条洗沉淀
，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中
。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1 、将菌株接种于液体LB培养基 ，37℃震荡培养过夜。

2
、取1.5ml培养物12000rpm离心2min 。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮
，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀 ，于37℃温育1h.

4 、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀
，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min
。

5
、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀 ，离心4-5min,将上清转入一只新管中
，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来 ，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后
，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1 、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉 。

2
、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1) ，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）
。

4 、以4℃
，1000rpm，离心5min。

5
、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次 。以4℃ ，10,000rpm，离心5min
。

6、取上清
，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7 、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中 。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL） ，37℃下处理1h
。

9
、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃
，10,000rpm，离心5min 。

10、取上清 ，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
。

11 、沉淀用75%乙醇漂洗
，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5） ，0.5MNaCl
，0.01MEDTA，1％SDS ，3MNaAc 。

第二种方法：

试验步骤：

1
、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液
，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3 、加入1mL5MKAc，冰浴20min 。

4
、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm ，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min
。

6 、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干
，重悬于500ulTE中。

7
、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h 。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次
。以4℃ ，10,000rpm
，离心5min。

9 、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上 。

10
、沉淀用75%乙醇漂洗 ，风干,溶于200ulTE中
，-20℃保存备用
。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法 。

二 、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响 ，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性
。在液氮中研磨
，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为CTAB)
、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate
，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白 ，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂
，能使蛋白质变性，并使抽提液分相 ，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强
，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质
。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中 ，即得植物总DNA溶液。

三 、实验材料

水稻幼叶

四
、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml
，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇 ，摇匀即可 。

五、实验步骤

1. DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中
，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中 ，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中
，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后 ，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min
，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时 ，将600 ?l的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后
，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内 ，将离心管慢慢上下摇动30 sec
，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体 ，注意勿将白色DNA沉淀倒出
，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管 ，加入720 ?l的75%乙醇及80 ?l 5 M的醋酸钠
，轻轻转动，用手指弹管尖 ，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后
，倒掉液体，再加入800 ?l 75%的乙醇 ，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后
，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后 ，直立离心管
，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 ?l 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解 ，置于37℃恒温箱约15 h
，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存 、备用
。

2. DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六
、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好 。

（2）移液器的使用
。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶 ，因此
，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速 ，以免组织解冻，导致细胞裂解
，释放出DNA酶，使DNA降解。

提取植物DNA常用的方法是CTAB法 。原理：CTAB是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性
。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl) ，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物
，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白 ，多糖
，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 。步骤如下：

1）取材料，加液氮研磨成粉末状 ，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；

（2）加入800 μl的CTAB提取缓冲液
，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次 ，20min后12000 r/min
，离心15 min；

（3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液 ，混匀，4℃
，12000 r/min，离心10 min；

（4）小心吸取上清液 ，加入等体积的氯仿
，混匀，4℃ ，12000 r/min
，离心10 min
。

（5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止；

（6）取上清 ，-20℃沉淀1h
，4℃，12000 r/min ，离心10 min；

（7）弃去上清液
，用70%乙醇洗涤沉淀2次；

（8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中 ，于-20℃或者-70℃下保存备用。

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